Produkce β-nikotinamid mononukleotidu (NMN) v Escherichia coli

Abstraktní

Cukrovka je chronické a progresivní onemocnění s neustále rostoucí prevalencí, rostoucím finančním tlakem na celosvětové zdravotnické systémy. Nedávno byla u myší léčených NAD ⁺ prekurzorem mononukleotidu p-nikotinamidu (NMN) vyléčena inzulínová rezistence, charakteristická pro diabetes typu 2, nebyly hlášeny žádné toxické účinky. Nicméně, NMN má vysokou cenovku, jsou zapotřebí nákladově efektivnější způsoby výroby. Tato studie navrhuje biotechnologickou metodu produkce NMN v Escherichia coli . Ukázali jsme, že bicistronická exprese rekombinantní nikotinamid-fosforibosyltransferázy (Nampt) a fosforibosylpyrofosfát (PRPP) syntetázy v přítomnosti nikotinamidu (NAM) a laktózy může být úspěšnou strategií pro nákladově efektivní produkci NMN. Proteinové expresní vektory nesoucí gen NAMPT z Haemophilus ducreyi a PRPP syntetázy z Bacillus amyloliquefaciens s mutací L135I byly transformovány v Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Produkce NMN dosáhla maximálně 15,42 mg na 1 bakteriální kultury (nebo 17,26 mg na gram proteinu) v těchto buňkách pěstovaných v médiu PYA8 doplněném 0,1% NAM a 1% laktózou.

Úvod

Podle Mezinárodní federace pro cukrovku byl v roce 2017 počet dospělých s diabetem typu 2 425 milionů a očekává se, že do roku 2045 dosáhne 649 milionů. V celosvětovém měřítku se vynakládá 12% rozpočtu na zdravotnictví (nebo 727 miliard USD). o léčbě cukrovky. Nedávné studie souvisely s inzulínovou rezistencí, charakteristickým znakem diabetu typu 2, se snížením mitochondriální funkce a snížením hladin NAD ⁺ a NAD ⁺ / NADH, které byly pozorovány také ve stárnutí. NAD ⁺ je přítomen ve všech živých organismech a je známým koenzymem v oxidačně-redukčních reakcích. NAD ⁺ závislé proteinové deacetylázy, jako jsou SIRT1 a SIRT6, slouží jako metabolické senzory a regulují downstream cesty, které nakonec obnovují mitochondriální funkci a citlivost na inzulín. Toto zjištění rozšiřuje oblast výzkumu účinků NAD ⁺ na další degenerativní choroby spojené se stárnutím, jako jsou: kardiovaskulární, rakovina, artritida, osteoporóza nebo Alzheimerova choroba.

P-nikotinamidový mononukleotid (NMN) je meziprodukt v biosyntéze NAD ⁺ produkovaný z nikotinamidu (NAM) a fosforibosylpyrofosfátu (PRPP) enzymem nikotinamid-fosforibosyltransferázy (Nampt) (EC 2.4.2.12). NMN byla dobře snášena, bez hlášených vedlejších účinků během dlouhodobého podávání u myší a bránila fyziologickému poklesu souvisejícímu s věkem. Ukázalo se, že NMN je účinná při léčbě cukrovky 2. typu vyvolané dietou s vysokým obsahem tuků, a to zvrácením mitochondriální dysfunkce spojené se stárnutím a záchranou účinek poklesu nervových kmenových buněk souvisejících s věkem.

NAM je obvykle převeden na NMN enzymy zapojenými do NAD ⁺ záchranných drah, jako je Nampt. Působení tohoto enzymu představuje hlavní anabolickou aktivitu NAD ⁺ v buňce. Regulace metabolismu a biosyntézy nukleotidů savců nebo mikroorganismů obvykle probíhá spotřebou PRPP. PRPP je výsledkem ribóza-5-fosfátu prostřednictvím oxidačních i neoxidačních větví pentózofosfátové dráhy.

U bakterií je NAM nejčastěji přeměňována na kyselinu nikotinovou (NA) pomocí nikotinamidázy, která je integrována do Preiss-Handlerovy cesty, což je také případ Escherichia col . U savců nebyla aktivita nikotinamidázy uvedena; NAM je místo toho přeměněn na NMN jedním z enzymů NAM fosforibosyltransferázy. Ačkoli většina bakterií postrádá NAM fosforibosyltransferázu, enzym je exprimován v Haemophilus ducreyi a Shewanella oneidensis .

Jednoduché a metabolicky všestranné organismy, jako je Escherichia coli , se často používají v biotechnologii pro řízenou expresi proteinů s požadovanou enzymatickou aktivitou. DNA kódující takové enzymy se často zavádí do bakterií pomocí expresních vektorů, jako je pET systém od Novagen. Vektory pET jsou transformovány v bakteriích exprimujících T7 RNA polymerázu, jako je E. coli . coli BL21 (DE3). Řízení exprese enzymů je dosaženo pomocí lac promotoru, který zapíná expresi pouze v přítomnosti laktózy (také metabolizované jako zdroj uhlíku) nebo jejího syntetického strukturního analogu, isopropyl-1-thio-β-D-galaktopyranosidu (IPTG) ( nemetabolizovaný, s konstantní koncentrací během procesu růstu). Protože bakteriální metabolismus je všestranný, jsou variace zdroje uhlíku a koncentrace substrátů enzymů doplněných médiem klíčovými faktory, které je třeba vzít v úvahu v biotechnologickém procesu.

S cílem řešit současný problém vysoké ceny NMN jsme v naší předchozí práci navrhli metodu čištění z bakteriálních buněk. Pro další optimalizaci procesu, protože jsme dokázali najít pouze jednu publikovanou metodu produkce kvasinek, tato studie navrhuje jednoduchou a nákladově efektivní metodu biotechnologické produkce NMN v Escherichia coli .

Výsledek

Bakteriální transformace

Vyrovnání několika aminokyselinových sekvencí vytvořené pro domnělé NadV z Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 a Nampt z Mus musculus , vykazuje vysokou podobnost (Obr. S1), což činí všechny tyto enzymy kandidáty na biotechnologický proces.

Transformovaná E. coli buňky s geny nadV (NAMPT) nesenými plasmidy pET28a (+) tvořily kolonie na LB agarových plotnách doplněných kanamycinem. Na destičkách inokulovaných netransformovanými bakteriálními buňkami nebyly detekovány žádné kolonie. Elektroforéza plazmidové DNA na agarózovém gelu izolovaná z těchto kolonií potvrdila přítomnost Nampt-PET28a, pET28a-soNadV nebo pET28a-hdNadV plasmidů v E. coli. coli DH5a (doplňkový obrázek S2A, dráha 2, 3, 4). Pásy DNA odpovídaly pásům z E. coli BL21 (DE3) pLysS buňky (doplňkový obrázek S2A, dráha 6, 7, 8), které byly transformovány odpovídajícími plazmidy extrahovanými přímo z E. coli . coli DH5a. V netransformované E. coli BL21 (DE3) pLysS buňky, použité jako negativní kontrola, byla přítomnost plazmidu pLysS potvrzena elektroforézou, na agarózovém gelu byl zobrazen pás odpovídající známé délce 4886 bp (doplňkový obrázek S2A, dráha 5).

(Další experimentální údaje naleznete na původním webu: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)